1927年5月下旬，周恩来由上海秘密到达中共中央所在地武汉。此前，在汉口召开的中共第五次全国代表大会上，周恩来被选为中央委员；在五届一中全会上，又被选为中央政治局委员。25日，中央政治局常委会议决定周恩来任中共中央军事部部长，必要时参加常委会议。29日，中央政治局常委会议决定周恩来代理中央常委职务，参加中央核心领导。从此以后，在长达半个世纪的时间内，周恩来一直是中共中央的主要领导人之一。

　　周恩来领导军事部后，以聂荣臻、王一飞、颜昌颐、欧阳钦等为助手，进行了对军队的组织、联络，加强了军队的政治工作，向国民革命军中派去朱德、陈毅、刘伯承等不少干部，并负责指导武汉的工人纠察队和湖南、广东的农民运动。这时，国民革命军独立第十四师师长夏斗寅在宜昌发动的武装叛变虽已击退，长沙许克祥又发动了反革命的“马日事变”，武汉汪精卫叛变革命的迹象越来越明显，周恩来主张在农民运动力量强大的湖南农村发动武装起义。6月17日，他在中共中央常委会上提出，现在湖南18县有8000枝枪，可以派人去集中起来，攻取反动力量弱的城池，计划取湘潭，集中浏阳、平江，省委下设军委，各区设农军委员会，在可能范围内成立乡村的临时委员会，对许多反动军队强则扰之，弱则缴其械。会议同意了这一布置。20日，周恩来在中共中央常委会上又说：湖南省委决定派50人回去，把湖南划为10个区，派10名懂军事的干部去，作好准备，根据政治局决定进行暴动。但这些意见遭到共产国际代表的反对，没有实现，陈独秀在7月5日的中央常委会上甚至说：军事工作应该收缩。

　　7月15日，汪精卫背叛孙中山的国共合作政策。他同蒋介石一样，对共产党员和革命群众进行大屠杀。

　　中国共产党决定举行南昌起义。

　　南昌起义的建议最早是谁提出来的？是周恩来。周恩来讲过这个过程，南昌起义的提出是这样的：“那时，军委想可否搞个起义，主要是鲍罗廷跟加伦说可以搞个起义，国际决定上没有。”而周恩来当时正是军委领导人。这时间是在7月中旬。根据这个考虑，周恩来向在军委工作的几个同志布置，指定贺昌、颜昌颐、聂荣臻组成前敌军委，聂荣臻为书记，任务是先到九江去，通知同志们了解这个意图，作为起义的准备。什么时候发难，要听中央的命令。

　　7月26日，周恩来由陈赓陪同到九江，27日到南昌。当时，中共临时中央常委会议已经正式决定，成立由周恩来、李立三、恽代英、彭湃组成的中共前敌委员会，周恩来为前委书记，用国民党革命委员会的名义在南昌举行武装起义。

　　8月1日凌晨，周恩来和贺龙、叶挺、朱德、刘伯承等领导在中国共产党掌握和影响下的国民革命军2万余人举行起义。经过几个小时的激烈战斗，全歼驻南昌国民党军3000余人，于拂晓占领南昌。

　　南昌起义开始了中国共产党独立地领导革命武装斗争和创建人民革命军队的新时期。从此，8月1日成为中国共产党领导下的革命军队的光荣节日。1933年6月30日，中央革命军事委员会决定以南昌起义的8月1日为中国工农红军成立纪念日，中华苏维埃共和国临时中央政府批准这个决定。中华人民共和国成立后，确定8月1日为建军节。

　　起义胜利后，周恩来出席在原江西省政府召开的有中国共产党人和国民党左派人士参加的联席会议。会议选出宋庆龄、邓演达、何香凝等25人组成中国国民党革命委员会。周恩来当选为委员，并被任命为参谋团委员。

　　同日，经周恩来修改定稿的《中央委员宣言》也发布了。宣言指出：“武汉与南京所谓党部政府，皆已成为新军阀之工具，曲解三民主义，毁弃三大政策，为总理之罪人，国民革命之罪人”。宣言提出号召一切革命力量共同努力，为获得一个新根据地，解决土地问题，反对帝国主义、封建势力和一切新旧军阀而斗争。

　　南昌起义的军事计划，是加伦制定的。当时说是苏联运来一船军人，起义军到汕头一带海口就可取得，因此，军事计划就定在起义军南下广东取得海港，得到苏联军火接济上。8月1日晚，周恩来主持参谋团委员会议，讨论南下行军路线问题。为了避免国民党军队的尾追堵截，尽快与东江农民暴动联络，会议决定选择走国民党兵力较为薄弱的由赣东经寻邬直取东江的行军路线。2日，中共前委对起义部队作了整编，决定沿用国民革命军第二方面军名义，下辖三个军，贺龙代第二方面军总指挥兼第二十军军长，叶挺代前敌总指挥兼代第十一军军长，朱德为第九军副军长。起义军从8月3日起，分批撤离南昌南下。

　　周恩来于8月5日随革命委员会机关撤离南昌。他的一生，勤勤恳恳，发愤为公，当年就已经如此。29岁的周恩来率领着几万人的起义军，由南昌向南挺进。有战士写道，“每天，当行军休息下来的时候，因为过度疲劳，我们总是一倒地就呼呼入睡。往往一觉醒来睁眼还看见周恩来同志在豆油灯下工作，或者踱着步子，默默沉思。”“我们对待周恩来同志的命令是绝对服从的，从不敢懈怠。这是因为周恩来同志对部下要求非常严格，而他对自己的要求尤其严格。”

　　12日，起义部队到达宜黄，周恩来同赶到部队来的陈毅谈话，任命他为第十一军第二十五师的主力团——第七十三团的指导员。

　　8月26日，起义军在瑞金以北的壬田，同布防在瑞金、会昌一线的国民党军钱大钧部两个团遭遇，将其击渍，进占瑞金。在这里，周恩来从报纸上得知各地国民党新军阀封闭工会、农会，捕杀共产党员和工农群众的消息，感到再继续沿用国民党的名义已经不合适。他主持召开中共前敌委员会议，决定要建立无产阶级领导的联合贫苦小资产阶级的工农政权，提出乡村政权应完全归农民，并须以农民为中心，城市政权，工人须占绝对多数。

　　30日，周恩来和叶挺，刘伯承、聂荣臻等，指挥起义军击溃国民党军钱大钧部九个团，占领会昌。在这里召开的中共前敌委员会议上，决定由福建长汀(汀州)、上杭进入广东东江地区。9月5日.周恩来率起义军到长汀。他主持中共前敌委员会议讨论攻取东江的计划。会上，周恩来和叶挺的主张是：国民党军在潮汕兵力空虚，无险可守，潮汕可以不战而得，因此如果以主力取潮汕然后再折回取兴宁、五华，攻惠州，就过于迂缓，会使国民党军有集中兵力，抢占有利地形攻击起义军的可能，应以主力由三河坝经松口取梅县；再经兴宁、五华取惠州，而以小部兵力，至多两个团趋潮汕。但是，会上多数人和共产国际军事顾问都主张以主力取潮汕，留一部分兵力在三河坝监视梅县方面敌军，再经揭阳出兴宁、五华取惠州，以便得到共产国际接济。后来，就按多数意见作出了决定。这个决定，是遭致后来失败的一个重要因素。

　　9月10日，周恩来和彭湃率一团起义军占领上杭。19日，占广东大埔县的三河坝。在三河坝，起义军实行分兵，由朱德率第十一军第二十五师和第九军一部留守三河坝，周恩来、贺龙、叶挺、刘伯承等率主力进军潮汕。23日进潮州，24日驻汕头。

　　在潮汕，起义军因为筹办军饷，延宕到26日才向揭阳集中，而这时，敌人重兵乘起义军进潮汕之机，抢先占领了揭阳、汤坑一带有利阵地。起义军入广东时共有兵力约10700人，这时二十五师约3000人留在三河坝，第二十军第三师约1000人留守潮汕，只有6000人的兵力进攻敌人。面对三倍于已的放军，起义军虽然作战勇敢，终因连续苦战，疲惫不堪，未能获胜，而另一路敌军已绕道后背，进占潮州。9月30日晚，周恩来主持召开中共前敌委员会议，决定放弃汕头，向普宁及海陆丰撤退。10月3日，他和贺龙、叶挺等到达普宁县的流沙。周恩来在这里召开了紧急会议，宣布打出苏维埃的旗帜，实行土地革命，决定武装人员去海陆丰帮助农民开展斗争，自己随部队行动；其余领导人分别转往香港或上海。

　　这时，周恩来正患恶性疟疾，连日发高侥，病势沉重。在当地中共组织的掩护和叶挺、聂荣臻的扶持下，乘小船到了香港治病。起义军余部，在颜昌颐、董朗率领下进入海陆丰地区同当地农军会合，组建为工农革命军第二师。留守三河坝的起义军，在朱德指挥下与国民党军钱大钧部激战后突围转移，然后在朱德、陈毅率领下，转战闽、赣、粤边，到湘南发动了年关起义，扩大衣军队伍达万人，最后上井冈山和毛泽东率领的秋收起义部队会师。

　　起义军南下虽然失败了，但南昌起义是胜利的。它打响了武装反抗国民党反动派的第一枪，开始了中国共产党领导下武装的革命反对武装的反革命的历史。

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